Korean Journal of Cerebrovascular Surgery 2009;11(1):12-18.
Published online March 1, 2009.
Radiation Induced Senescence-like Changes of Endothelial Cells and Blood-brain Barrier Disruption.
Bang, Jae Seung , Kwon, O Ki , Oh, Chang Wan
1Department of Neurosurgery, East-West Neo Medical Center of Kyung Hee University, Seoul, Korea.
2Department of Neurosurgery, Bun-dang Seoul National University Hospital, Department of Neurosurgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea. wanoh@snu.ac.kr
Abstract
OBJECTIVE
S: This study was performed to evaluate the relationship between radiation induced senescence-like changes of endothelial cells and blood-brain barrier disruption. MATERIALS AND METHODS: Radiation of 15 Gy was applied to a monolayer culture of bovine aortic endothelial cells (BAEC). The morphological changes were observed over 19 weeks. An artificial blood-brain barrier (BBB) model was constructed using the Transwell(R) and co-culture of the BAEC with C6 glioma cells. After treatment with the same dose of radiation, changes in the BBB were observed by measurement of the trans-endothelial electrical resistance (TEER). RESULTS: Senescence-like changes of the endothelial cells appeared 1 week after irradiation; it was most prominent during the third week and replacement by normal endothelial cells was noted from the seventh week. The recovered normal endothelial monolayer was maintained until the 19th week. Senescence-like endothelial cells showed positive staining with senescence-associated beta-galactosidase (SA-beta-gal). In the Transwell(R), the TEER began to decrease 1 week after irradiation, and the decreased resistance reached its peak 18 days after irradiation, and then began to recover to some degree. CONCLUSION : After application of radiation (15 Gy), senescence-like changes of the endothelial cells were observed in the monolayer culture. These findings demonstrated good correlation with the disruption of blood-brain barrier in an in-vitro model of the BBB.
Key Words: Senescence, Endothelial cells, Radiation, Blood-brain barrier
 

서 론

이온화 방사선 조사(ionizing radiation)는 양성 및 악성뇌종양, 뇌혈관 기형 등 중추신경계 질환의 치료에 자주 사용

된다. 방사선 조사의 치료 효과는 조사 후 수 미리 초(several milli-seconds)이내에 발생하는 자유기(free radical)가 염

색체를 파괴하여 세포를 사망하게 함으로써 이루어지는 것으로 여겨지고 있으며,4) 이러한 기전이 정상조직에도 작용하여

부작용을 유발할 수 있다.

뇌 및 척수에 대한 방사선 손상 중 일부는 정상 혈관 손상의 결과이다.21) 이온화 방사선 조사는 장기적으로 뇌혈관 협착 및

폐색, 뇌동맥류, 뇌 괴사, 모야모야 증후군, 동맥경화, 뇌출혈, 혈뇌장벽 장애 등을 야기 시킬 수 있으며,22) 이러한 혈관

에 대한 영향이 중추 신경계 방사선 치료의 제한 요인 중 하나이다. 본 연구에서는 방사선 조사 후 발생하는 내피세포의 유

사-노화 현상과 혈뇌장벽 장애의 관련성에 대하여 실험을 시행하였다.


재료 및 방법

1. 내피세포 배양

내피세포는 소 대동맥 내피세포(BAEC; bovine aortic endothelial cells; Cell Applications, Inc.)를 사용하였다.

동결된 소 대동맥 내피세포를 일반 배양 플라스크에서 배양을 시작하여 양을 늘린 후, 9~21계대 배양된 세포를 실험에 사

용하였다. 배양액은 DMEM/F12 배지에 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin 및 fungizone을 혼합하여 사용하였다. 내피세포에 대한 방사선 조사 후 형태학적 변화를 관찰하기 위하여, 60 mm 페트리 디쉬(petri-dish)에 내피세포

(BAEC)를 배양하여, 세포가 전체 표면을 모두 덮은 후 2일 경과하여 방사선을 조사하였으며, 배양액은 격일로 교환하였

다. 실험군과 대조군 각각 4개씩을 유지하며 대표적인 변화 소견을 관찰하였다.

2. 교세포 배양

실험에 사용할 교세포는, 장기적 실험을 위하여 배양 시 장기적 세포 생존이 가능한 C6 교종세포를 사용하였다. 배양에

앞서 배양면에 대한 fibronectin 도포를 시행하였고, 배양은 glutamine, penicillin, streptomycin, fungizone 등을 함

유한 DMEM (1.7g/L glucose) 배지를 사용하였다.

3. 노화 관련 senescence-associated β- galactosidase (SA-β-gal) 염색 세포 노화(senescence) 감별을 위하여, 거대세포로 변형된 내피세포에 대하여 SA-β-gal 염색을 시행하였다.6) 세포를 PBS로 세척 후 상온에서 2% formaldehyde/0.2%

glutaraldehyde 용액으로 3�분간 고정한 후 다시 PBS로 세척하였다. 이후 SA-β-gal 염색액으로 핵주변 세포질이 확

실하여질 시기까지 4�시간 염색하였다. SA-β-gal 염색액 은 신선한 것을 사용하여야 되며, 그 성분은 다음과 같다: 5-

bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) 1 mg/ml, citric acid 100 mM, sodium phosphate dibasic 200 mM, potassium ferrocyanide 5 mM, potassium ferricyanide 5 mM, NaCl 150 mM and MgCl2 2 mM; pH 6.0.

4. Transwell혈뇌장벽 모델

Costar Transwellmembrane insert (polyester, 12mm, 0.4 μm pore size)를 사용하여 그 상부에 내피세포를 배양하고 하부에 교세포를 배양하였다. Fibronectin 도포 후 먼저 insert를 뒤집어 놓아 바닥면을 위로 향하게 하여 그 위에 교세포를 4일간 배양하여 부착시켰다. 이때 insert를 100mm 세포배양 플라스크에 놓고 배양액이 배양막까지 차도록 유지하였다. 교세포 부착 후 insert를 Transwell��에 다시 넣고 배양막 상부에 내피세포를 배양하여 부착시켰다. 내피세포는 9계대 배양된 것을 사용하였으며, 배양액은 내피세포 배양시와 같은 것을 사용하였다. 내피세포가 전체 표면을 모두 덮은 후 2일 경과하여 방사선을 조사하였으며, 배양액은 격일로 교환하였다. 실험군과 대조군 각각 8개씩의 Transwell��을 유지하였다.

5. 내피세포 및 Transwell방사선 조사

형태학적 변화의 관찰을 위한 페트리 디쉬에 배양한 내피세 포단막(endothelial monolayer)에 대하여, 실험군의 경우

15 Gy를 조사하였고, 동일 조건에서 대조군을 유지하였다. Transwell��의 경우에서도, 실험군에는 15 Gy를 조사하였고

동일 조건에서 대조군을 유지하였다. 모든 경우 방사선 조사 24시간 전에 배양액을 교환하였다.

6. 혈뇌장벽의 검사

방사선 조사 후 혈뇌장벽의 변화는 경내피세포 저항(transendothelial electrical resistance; TEER)을 측정하여 추정

하였다. EVOM epithelial voltohmmeter (World Precision Instruments, Sarasota, Florida)를 사용하여 Transwell��

상부와 하부 사이의 저항치를 측정하였으며, 상대적인 변화를 관찰하는 것이므로 표면적에 따른 보정은 하지 않았다. 정확도

를 높이기 위하여 ENDOHM 전극(12 mm, World Precision Instruments)을 이용하여 저항을 측정하였다.

7. 방사선 조사 후 검사

내피세포 배양에 대한 방사선 조사후 형태학적 변화는 위상 대조 현미경 (phase contrast microscope)을 이용하여 매

1�주 간격으로 시행하였다. 세포의 형태학적 변화가 뚜렷한 시점에서, 실험군과 대조군 각 1개씩의 페트리 디쉬를

SA-β-gal 염색 처리 하여 세포 노화 현상을 확인 하였다. TEER 측정은 대조군과 15 Gy 방사선 조사군 각각 8개씩

의 Transwell��에서 측정하여 그 평균치를 구하였다. 측정은 방사선 조사 직후 및 이후 2�일 간격으로, 세포 폐사로

TEER이 급격히 감소하는 시점까지 지속하였다.

결 과

1. 방사선 조사 후 내피세포의 시간 경과에 따른 형태 변화 배양 9계대 내피세포를 15 Gy 방사선 조사하고, 형태학적

변화를 위상 대조 현미경(phase contrast microscope)을 이용하여 관찰하였다. 방사선 조사 1주 후, 3주 후 및 이후 2

주 간격으로 19주까지 관찰하였다. 대조군은 19주까지 형태학적 변화가 없었다. 대조군(Fig. 1-A)에 비하여, 실험군의

경우 1주 후 일부 세포의 크기가커지는 양태를 보였으며 (Fig. 1-B), 3주 후에는 뚜렷한 거대 세포들이 나타났다(Fig.

1-C). 거대세포는 세포핵과 세포질 모두 그 표면적의 증가를 보였으며, 특히 세포질의 양이 크게 증가하였다. 방사선 조사

5주 후에는 전체적으로 많은 세포들이 죽어가는 양태를 보였으나(Fig. 1-D), 7주 후부터 다시 건강한 세포들이 증식하는

소견이 나타나서(Fig. 1-E) 이후 19주까지 대부분의 영역에서 건강한 세포들로 대체 되어 있는 양상을 유지하였다(Fig. 1-F).

3. 노화 관련 SA-β-gal 염색

배양 9계대 내피세포를 15Gy 방사선 조사하고, 3주 경과하여 SA-β-gal 염색을 시행하여, 거대세포의 노화를 검사하였다. 형태학적 변화를 위상 대조 현미경을 이용하여 관찰하였고(Fig. 3-A), 동일 부위의 SA-β-gal 염색 소견을 일반 현

미경으로 관찰하였다(Fig. 3-B). 거대세포 대부분에서 핵 주변 세포질의 SA-β-gal 염색 양성 소견이 관찰되어, 이러한

거대세포가 노화현상을 보이고 있음을 확인하였다(Fig. 3-B).

4. 방사선 조사 후 경내피세포 저항의 변화

Transwell��에 내피세포와 교세포를 부착하여 혈뇌장벽 모델을 형성한 후 15 Gy 방사선을 조사하고 경내피세포 저항

(TEER)을 2�일 간격으로 측정하였다. 대조군은 방사선 조사 후 25일까지 비교적 일정한 TEER 수치를 유지하다가 이

후 급격한 감소 추세를 보였다. 방사선 조사 후 7일 경과하여 실험군 Transwell��의 TEER이 대조군에 비하여 감소하기 시

작하였으며, 이후 그 격차가 점차 증가되어 13일에는 유의한 차이를 보였고(p=0.04), 18일에 그 격차가 최고에 도달하였

다. 이후 22일, 25일에 다소 격차가 감소하는 추세를 보이다가 27일 경 대조군과 실험군 모두 TEER의 감소를 보이며 29

일에는 급격한 감소를 보였다(Fig. 4). TEER의 급격한 감소를 보인 시점에서 현미경 검사상 대부분의 세포가 사망한 소

견이 관찰 되었다.


고 찰

혈관의 구성 세포 중 특히 내피세포는 방사선에 대하여 취약하며, 방사선 조사 후 급성기의 여러 반응에 대한 연구가 있

었 다 .22) 특 히 , 소 대동맥 내피세포(bovine aortic endothelial cells; BAEC)를 배양하여 실행한 실험에서 이러한 변화가 자연적 세포노화 현상과 유사함을 관찰할 수 있었다. 즉, 방사선 조사 후 계대배양(subculture)을 하지 않아도 계대배양에 의해 유도된 자연적 세포노화 현상과 동일한 변화를 관찰 할 수 있었다.23) 세포체의 크기가 증가하는 형태 학적 변화를 보였으며, 세포의 표면적이 방사선 조사량에 비례하여 증가하였고, 이러한 세포들은 SA-β-gal에 양성 반응을 보여 자연적 노화 세포와 유사한 생화학적 특성을 보였다. 이러한 유사-노화 세포는 p21의 지속적 상승을 보여, 본 현상이 방사선 조사 후 일시적으로 나타나는 세포 괴사와는 달리 자연적 세포노화(natural cellular senescence)와 유사함을 확인할 수 있었다.23) 본 연구에서는 이러한 유사-노화 현상의 장기적 변화를 관찰하기 위하여, 계대배양 수가 적은젊은 BAEC의 단층 배양 상태에서 15 Gy의 방사선 조사 후 19주 이상 형태학적 변화를 관찰하였다. 계대배양 수가 적은 젊은 BAEC를 사용한 이유는 세포배양이 비교적 쉽고, 다음 단계의 혈뇌장벽 실험시 교세포와 동시 배양하면 혈뇌장벽을 잘 형성하기 때문이다.12)33) 본 실험 결과, 내피세포의 유사-노화 현상은 방사선 조사 후 1주 경과하여 발현되기 시작하여 3주 후 절정에 도달하였으며, 5주경에는 많은 세포들이 사망하는 양태를 보였으나 7주경에는 건강한 세포들이 증식하여 빈공간을 채웠다. 이러한 정상 내피세포의 상태는 19주까지도

잘 유지되었다(Fig. 1). 방사선 조사 후 단층 배양에서 발현된 유사-노화 현상은 계대배양 수가 높은 노화 세포에서 더 강하

게 나타났으며, 이는 방사선에 의한 유사-노화 현상과 자연적 노화 현상의 유관성을 시사하여 주는 것으로 생각된다(Fig.

2). 유사-노화 현상을 보인 세포들은 SA-β-gal에 양성 염색되어, 역시 생화학적으로 자연적 노화 세포와 유사한 특성을

보였다(Fig. 3). 이러한 유사-노화 현상의 발현 및 회복은 방사선 치료 후 혈뇌장벽 장애의 발생 및 회복 경과와 매우 유사

하다. 즉, 뇌의 일반적 방사선 치료 및 정위적 방사선수술 후 3�2개월 경과하여 발생하는 혈뇌장벽 장애는 수주��수개월

지속된 후 회복을 보이는데, 본 실험의 관찰 결과에서도 방사선 조사 후 유사-노화 현상을 보이는 세포들의 수가 1주 후부

터 점차 증가 되었다가, 이러한 세포들이 사라지면서 7주경 부터는 정상 내피세포로 교체되어 회복되는 현상이 관찰 되었

다. 생체에서의 변화는 그 시간 경과가 더 느리게 나타나지만, 이는 생체 외 실험에서 세포의 변화가 통상적으로 더 빠르게

나타나는 현상에 기인하는 것으로 생각된다.

내피세포의 방사선 조사 후 관찰된 유사-노화 현상과 뇌 방사선 치료 후 발생하는 혈뇌장벽 장애의 관련성을 확인하기 위하여, BAEC와 C6 교종세포를 Transwell��에 동시 배양하여‘인공 혈뇌장벽 모델’을 만들어 실험을 시행하였다. 혈뇌 장벽은 혈액과 중추신경간의 물질 교환을 선택적으로 조절하여 주는 역동적 경계이며, 이러한 기능은 주로 내피세포에서 이루어지고 교세포 및 호르몬 등의 영향을 받는다.1) 뇌의 미세혈관 내피세포는 세포흡수작용(pinocytosis)이 적고 천공 (fenestration)이 없으며 세포외 물질투과를 막는 폐쇄소대(tight junction)가 있다.1) 생화학적으로는 특이한 선택적 물질이동 기전과 관련된 amma-glutamyltranspeptidase, glucose transporter type 1 (GLUT-1), P-glycoprotein, alkaline phosphatase, Na+-K+-ATPase, Ca++-ATPase, and 5’-nucleotidase 등의 표식자가 특징적으로 나타난다.25)

이러한 혈뇌장벽 표식자는 뇌혈관 및 비-뇌혈관 내피세포 모두에서 발현될 수 있으며,25)35) 교세포의 세포막 구조물 혹은

용해성 분비물이 내피세포에 작용하여 이러한 혈뇌장벽 특성을 유도하는 것으로 추정된다.1)30) 따라서 실험실에서‘인공 혈

뇌장벽 모델’을 만들기 위해서는 내피세포와 교세포의 동시배양이 필요하며, 이러한 목적으로 가장 간단한 것은

Transwell��을 사용하여, 배양막의 상부에는 내피세포를 하부에는 교세포를 배양하는 것이며, 본 실험에서는 이러한 모

델을 사용하였다. 방사선 조사 후 혈뇌장벽의 변화는 배양막 상부와 하부간의 경내피세포 저항(trans-endothelial

electrical resistance; TEER)을 측정하여 추정하였다.9)11)12)16) 실험 결과, 방사선 조사 후 1주 경과하여 실험군의

혈뇌장벽 장애가 관찰되기 시작하였으며, 18일경 장애가 절정에 도달하였고, 이후 다소 회복을 보이는 추세를 보였다

(Fig. 4). Transwell��의 경우 배양 세포의 생존 기간이 상대적으로 짧아, 방사선 조사 4주 경과하여 대부분의 세포들이

사망하여 좀 더 장기적인 변화를 관찰할 수는 없었다. 그러나 관찰 기간 중 내피세포의 단층배양에서의 유사-노화 현상 발

현과 유사한 경과를 보이는 혈뇌장벽 장애의 발생을 확인할 수 있었다. 방사선이 교세포에 미치는 영향이 혈뇌장벽 장애

에 기여할 가능성도 있으나, 방사선 조사 후 동물 교세포의 조직학적 변화는 미미하고,17) 본 연구자의 예비실험에서도 동일

량의 방사선 조사 후 교세포는 내피세포에 비해 큰 변화를 보이지 않아 그 기여도는 적을 것으로 추정되며, 이러한 혈뇌장

벽 장애 발생의 주 원인은 내피세포의 변화일 것으로 추정된다.

본 연구의 결과는, 방사선 조사 후 관찰되는 배양된 내피세포의 유사-노화 현상이 방사선 치료 후 발생하는 일과적 혈뇌

장벽 장애와 관련성이 있음을 시사하고 있다. 세포 노화 현상(cellular senescence)이란 생체 노화 현상(aging)과 대비된

생체 외 배양세포의 노화 현상을 지칭한다.10)15)27) 노화 세포(senescent cell)는 영구적으로 세포분열 능력이 없으며, 특

징적인 세포 기능 변화를 보인다.24)29) 생화학적으로는 telomere의 단축,8) telomerase의 억제,29) 산화성 DNA 손

상,5) 각종 종양억제 유전자(p53, pRb, p16INK4a and p21WAF1)의 발현2)28)34)36) 및 발암 유전자(proto-oncogenes)의 이상 발

13)31) 등이 나타난다. 노화세포와 단순히 분열을 멈춘 세포(quiescent cell)를 감별할 수 있는 표식자로는 SA-β-gal,6)

변형된 fibronectin 발현,14) interleukin-1α7) 등이 있다. 한편, 방사선 조사된 세포 중 세포분열 능력을 상실한 세포

(clonologically dead cells)들은 특징적으로 노화 세포와 유사한 형태로 변화되며, 이러한 세포 중 일부는 노화세포에 특

이하게 반응하는 항체에 대해서도 양성 반응을 보이는 것으로 알려져 있다.26) Bey-Dih 등3)은 방사선 및 항암제로 처치한

종양세포가 노화세포와 유사한 특징을 보이며, 노화세포 표식자인 SA-β-gal에 반응하고 영구적으로 분열이 불가능한 것

으로 보고하였다. 이러한 현상은 방사선에 의한 염색체의 영구적 손상이, 반복 세포분열에 의한 telomere 손실이 유발하

는 자연적 세포노화(natural senescence) 현상과 유사한 작용을 하는 것으로 설명할 수 있다. 이러한 방사선 조사 세포들

은 염색체 손상으로 세포분열 능력은 잃었으나 상당기간 생존이 가능한 것으로 알려져 있다. 본 연구에서도 배양중인 내포

세포에 방사선 조사 후 유사-노화 세포가 생성되며, 이러한 세포들이 정상 내피세포로 교체되기 까지 수 주간 생존하는

것을 확인 할 수 있었다. 한편, 노화된 동물은 혈뇌장벽의 변화를 보여 선택적 투과성이 상실되며 특히 choline,18)

glucose,20) triiodothyronine19) 등에 대하여 그러하다. 인간태정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell;

HUVEC)를 이용한 실험에서 내피세포 노화는 여러 유전자 발현의 변화를 보였으며, 이들 중 일부는 혈관 기능과 중요한

관련이 있을 것으로 추정된다.32) 본 연구의 결과는, 방사선 조사로 유발된 내피세포의 유사-노화 현상 역시 혈뇌장벽의 장

애 발생과 관련이 있음을 시사하고 있으며, 이는 자연적 노화에서 관찰되는 혈뇌장벽 장애 현상과 유사성이 있다.


결 론

배양된 내피세포에 방사선 조사 후 장기간 관찰한 결과 일시적으로 유사-노화 세포들이 발생하며, 이러한 세포들은 수

주간 생존하였다가 점차 정상세포로 대체되어 회복되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 내피세포의 변화는 방사선 조사 후

발생하는 일과성 혈뇌장벽 장애와 관련성이 있을 것으로 사료된다.


중심 단어 : 세포노화∙내피세포∙방사선조사∙혈뇌장벽.


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