서     론

   뇌졸중(stoke)은 뇌혈관이 막혀서 국소적인 허혈 또는 경색으로 인하여 유발되며, 노년층에서 장애를 유발하는 주요 원인 중의 하나이다.^7)12)22) 이미 손상을 받은 신경조직은 재생이 되지 않는데, 뇌졸중의 치료로 발병 전에는 혈액응고를 예방하는 약을 복용하거나 혈관내 혈전제거술, 발병 후에는 뇌혈관을 문합하는 수술적 치료 그리고 발병 후 신경학적 결손이 유발되었을 시에는 기능향상을 위한 재활치료를 시행하는 정도에 머무르고 있다.³²⁾ 발병후 즉각적인 의학적 치료에도 불구하고 많은 환자들에서 영구적인 장애를 남기는 뇌졸중은 예방적이고 보존적인 치료뿐만 아니라 손상된 신경조직의 기능회복과 같은 적극적인 치료가 요구된다. 
   최근 신경조직의 기능회복에 있어서 cell-based therapy에 많은 관심이 집중되고 있는 가운데 줄기세포를 이용한 연구가 많아지고 있다.^4)8)14)15) 이론적으로 줄기세포(stem cell)는 자가 생성(self renewal)과 다양한 결합조직(connective tissue)으로 분화될 수 있고 쉽게 뇌혈관장벽(blood brain barrier)를 통과할 수 있어 사람에서 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)을 치료하는 데도 가능성이 높아 보인다. 그 중 윤리적 문제에서도 자유롭고 면역학적 거부반응의 문제도 없어서 골수 줄기세포가 많이 이용되고 있다. 
   특히 최근에 Chopp 등은 연구에서 동물실험에서 중간엽줄기세포 이식 후 이식된 세포들이 뇌에서 생존할 뿐만 아니라 손상 부위로 이동하고 신경원, 성상세포 등을 포함한 신경세포로 분화했으며 신경학적 기능이 향상되었음을 발표하였다.⁵⁾⁶⁾
   이번 연구에서는 아직은 이식 후의 안전성을 확신할 수 없는 유전자 조작 등을 하지 않고, cytokines을 이용하여 신경세포로 분화 유도된 사람의 중간엽줄기세포(Ci-hMSC)를 뇌허혈을 유발시킨 쥐의 뇌 속에 이식하여 허혈부위로의 이동을 관찰하고 이식을 통한 자극으로 숙주인 인간 자신의 신경원조세포의 활성 및 유동성을 증가시켜 뇌손상에 대한 신경재생에 직접 참여할 수 있도록 하여, 좀 더 효과적인 신경세포의 재생 및 신경기능의 회복을 도모하고자 하였다. 

재료 및 방법

1. 사람의 중간엽줄기세포(Human Mesenchymal Stem Cells；hMSCs)의 준비
   정 상인의 골반에서 국소마취하에 14G-puncture needle을 이용하여 5 ml의 골수(bone marrow)를 채집하여 heparin tube에 빠르게 옮겨 담은 후, 5 ml의 phosphate buffering solution(PBS)을 섞어 Ficoll에 띄워 원심분리하였다(2000 rpm, 20℃, 20 min). 원심분리로 단핵구세포만 수집하여 DMEM(10% FBS)를 넣고 배양한(37℃, 5% CO₂) 후 단핵구세포에서 hMSC만을 선택적으로 분리하여 배양하였다. hMSC를 계대배양하였고, 초기 계대배양에서 증식된 hMSC를 3~4 일에 한번 씩 여러 가지 cytokine으로 처리하여 신경세포로 유도하였다. 분화 10일째 신경세포로 유도된 hMSC를 현미경으로 관찰한 후 모아서 PBS로 두 번 세척한 후 Hanks balanced salt solution(HBSS)에 부유하였다(FCB-Pharmicell 연구소 제공).

2. 동물모델 

1) 실험동물 및 뇌졸중 동물 모델 제작
   실험동물은 72마리의 무게 230~250 g의 성숙한 Sprague-Dawley(Sam：TacN(SD) BR, Korea) 암컷 백서를 대상으로 하였다. 400 g/kg chloral hydrate를 복강내 주사를 통하여 마취를 시행한 후 목 부위의 정중선을 따라 2 cm 정도 절개하였다. 왼쪽 총경동맥, 외경동맥, 내경동맥 그리고 후교통동맥을 미주신경이 손상되지 않도록 조심하면서 노출시킨 후, 먼저 총경동맥과 외경동맥 그리고 후교통동맥의 말단부위를 결찰하고 내경동맥의 말단부위는 micro clip으로 결찰한 후, 외경동맥의 혈관벽에 가위를 이용하여 작은 구멍을 만들었다. 불을 이용하여 끝부분을 둥글게 해준 4-0 silk suture를 clip을 제거시키면서 작은 구멍을 낸 외경동맥으로부터 내경동맥을 통하여 중뇌동맥을 막을 때까지 천천히 밀어 넣었다(2.0~2.3 mm). 2시간 후에 중뇌동맥를 막았던 silk suture을 제거시켜 재관류 시킴으로서 모델을 완성시켰다. 수술적 처치를 시행하는 동안 디지털 온도계를 이용하여 직장내 온도를 37℃로 유지하도록 하였다.

2) 실험 그룹 및 이식 방법
   72마리의 adult female rats을 무작위로 선정하여 3개의 실험군으로 나누었다(각 7일, 14일, 28일, 56일 n=6씩). Group 1은 PBS를 주입한 대조군이고 group 2는 뇌졸중 유발후 hMSC을 이식하였고 group 3는 뇌졸중 유발후 Ci-hMSC를 이식하였다.

   Group 1(control；PBS)：n=24
   Group 2(human MSC)：n=24
   Group 3(cytokines inducted human MSC)：n=24

   Transient focal cerebral ischemia를 유발한 후 24시간 뒤에 꼬리정맥을 통하여 실험군 각각에 PBS 1 ml, hMSC 1×10⁶cells/1 ml HBSS 그리고 Ci-hMSC 1×10⁶cells/1 ml HBSS를 이식하였다. 

3. 조직학 및 면역조직학적 평가

1) 뇌허혈부위의 부피 측정
   뇌허혈의 확인과 부피 측정을 위해 중뇌동맥의 결찰 후 24시간 뒤에 희생시킨 실험동물로부터 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌는 곧바로 rodent brain matrix(Harvard Instrument Inc., South Natick, MA)에 고정시킨 후 2 mm 두께로 coronal section을 시행하여 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC, T-8887, Sigma chemical, Steinheim, Germany) 용액으로 염색(37℃에서 30분)한 후 10% 포르말린에 넣어 고정시켰다.
   염색된 조직은 스캐너를 사용해 스캔하고, TINA software를 사용하여 뇌경색부피를 계산하였다. 

2) 조직의 처리 
   세포를 이식했던 동물모델들은 세포 이식 후 1, 7, 28, 56일 간격으로 관류 고정하였다. 관류고정은 먼저 chloral hydrate를 복강에 주입하여 마취를 시킨 후 흉곽을 열고 심장을 통하여 생리 식염수(0.9% heparinized saline)를 관류시켜 혈관내 혈액 성분을 제거하고, 2% paraformaldehyde(in 0.1M PBS, pH 7.4) 250~300ml을 관류시켜 뇌를 고정시켰다. 고정된 뇌조직은 이식된 hMSC의 확인과 면역염색을 위해서 슬라이드를 만들었다. 뇌조직은 OCT(optimal cutting temperature gel) compound에 포매하고 동결한 후 cryostat(LEICA CM 3000)을 사용하여 30 μm두께로 연속 절단하여 gelatin 코팅된 슬라이드에 붙여서 보관하였다. 

3) 조직의 염색 
   뇌허혈에 의한 뇌조직 괴사부위 주변에 있는 세포가 이식된 hMSC로부터 유래된 세포인가를 확인하기 위하여 면역형광염색을 시행하였다. 이식된 세포의 확인을 위해 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) staining을 시행하였고 light eosin으로 counterstaining을 하였다. 허혈후 PBS만 주입한 대조군의 조직은 Hematoxyline and eosin(H & E)으로 염색하였다. 
   이식된 hMSC의 분화여부를 확인하기 위하여 이중면역형광염색을 실시하였다. 이식한 hMSC와 모델 자체의 세포를 구분하기 위해 일차 항체로 β-galactosidase(dilusion 1：500, Sigma)를 사용하였고 2차 항체는 texas red(1：00；Vector laboratories, Burlingame, CA)를 사용하였다. 이식한 hMSC의 분화를 알아보기 위한 cell-specific marker로서 신경원에 대하여 Neuronal Nuclear Antigen(NeuN, dilution 1：300；Chemicon), 성상세포에 대하여 Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP, dilution 1：300；Sigma)을 사용하였다. 염색된 조직은 confocal-scanning microscope하에서 관찰하였다.

4. 행동평가검사
   Modified Neurological Severity Score test(mNSS test)(Table 1)와 Rotarod test를 이용하였다. 

1) Modified Neurological Severity Score(mNSS) test
   Modified Neurological Severity Score test는 신경학적 기능을 측정하기 위한 구성표이다. Motor(muscle status)와 mensory(visual, tactile and proprioceptive) 항목으로 평가하였다. 점수가 높을수록 기능이상의 정도가 심한 것으로 정상은 0점에서 가장 심한 신경장애 점수는 11점이다.
   정상적인 실험동물의 경우는 꼬리를 잡고 지면에서 15 cm정도 지상으로 들어 올렸을 때 양 다리를 신전하면서 바닥을 주시하는 자세를 취하며 어떠한 신경학적 이상도 보이지 않았다. 그러나 중뇌동맥 결찰로 뇌허혈이 성공적으로 유발된 동물은 특징적인 자세를 취하였다. 실험동물들을 꼬리를 잡고 지상으로 들어 올렸을 때 몸을 뇌허혈이 유발된 부분의 반대방향으로 꼬아서 올라오며(C-shped lateral bending of the body) 앞발이나 뒷발이 굴곡을 취하기도 하였다. 
   탁자 위에 앞발을 올려놓음으로써 각 앞발의 sensorimotor function을 평가하는 forelimb placing test는 visual, tactile & proprioceptive stimuli를 포함하여 시행하였다. Visual limb placing test는 실험동물을 가볍게 쥐고 테이블 표면과 눈높이를 맞추어 천천히 다가가면서 앞발을 앞으로 내밀게 하여 테이블 표면에 접촉하였다. 정상의 경우에는 앞발이 테이블 표면에 닿게 되면 테이블 표면에 발을 뻗으며 올려놓게 되지만 이상이 있는 경우에는 앞발이 테이블 표면에 닿아도 반응하지 않았다. 실험동물을 테이블 모서리와 같은 눈높이로 향하여 측면으로 움직이면서 앞발을 접촉하게 하는 실험도 위와 동일한 방법으로 실시 하였다. 
   Tactile/proprioceptive limb placing test는 실험동물을 테이블 모서리에 수평으로 움직이지 못하게 고정시킨 후 앞발을 수직으로 모서리의 측면에 가볍게 접촉하게 하였다. 정상의 경우는 앞발이 가볍게 접촉되자마자 앞발이 있던 원상태로 올라가지만 이상이 있는 경우에는 접촉 후에도 반응하지 않았다. 실험동물이 접촉에 반응을 보이지 않는 경우에는 테이블 모서리에 내려져 있는 앞발에 약하게 또는 강하게 일정한 자극을 주었을 때 반응을 보이는지 관찰하였다. 
   각각의 실험은 이식 후 1, 3, 7, 14, 28, 56일에 시행하며 3번씩 반복하였다. 실험동물의 facial contact stimuli를 피하기 위해 실험동물의 턱을 고정시켜 머리를 45° 정도로 들어 올려 실험하였다. 

2) Rotarod test
   Rotarod test의 결과는 동물모델의 균형능력과 전정-운동 기능을 평가할 수 있는 확실한 척도이다. 모든 실험동물은 뇌허혈을 유발하기 위한 시술 3일 전부터 매일 3회 연습을 시키고 학습이 잘된 동물을 선별하여 뇌허혈동물모델을 만들었다.
   실험동물을 고무표면으로 된 회전봉(직경 3 cm)에 올려놓고 가속화되는(4-40 rpm) 회전봉에서 낙하할 때까지의 시간을 측정하였다. 실험은 동물모델이 봉에서 완전히 떨어지거나, 봉을 붙잡고 늘어지게 되면 끝낸다. 이때 한번 시행할 때의 최장 관찰시간은 5분간으로 하고 3회 시행하여 3번의 평균성적을 집계하였다. 

3) 통계 처리
   Modified Neurological Severity Score test와 Rotarod test에 의하여 얻은 수치를 SPSS^®을 이용하여 반복 측정된 자료의 분산분석법(repeatative measure of ANOVA)을 통하여 통계 처리하였다. 

결     과

1. 뇌허혈 부피의 측정
   뇌졸중 모델을 만든 후 24시간 후에 뇌를 적출하고, 적출한 뇌는 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) 염색에 의해 뇌의 손상여부와 부위를 확인하였다. TTC 염색은 세포내의 정상 mitochondrial oxidative enzyme system과 반응하여 염색되는데, 뇌허혈 손상을 받아서 mitochondria가 손상되면 oxidative system이 교란되어 염색이 되지 않아 흰색을 나타내므로 뇌의 손상부위를 구별할 수 있었다. 중뇌동맥결찰에 의해 유발된 손상은 주로 왼쪽 뇌의 피질부위와 선조체 부위에 발생하였고(Fig. 1), PBS로 처리한 대조군과 hMSC로 처리한 군 간의 뇌허혈 부피에는 큰 차이가 없었다. 손상부위의 크기는 스캐너로 스캔한 후 컴퓨터로 TINA software를 사용하여 측정하였고 측정결과는 평균 312.0221 mm³이었다. 

2. 이식된 세포의 이동과 분화
   LacZ-expressing donor-derived cell을 알아내기 위하여 X-gal 면역형광염색를 시행하였고 hMSC의 이식에 의한 이식세포의 생존은 X-gal reaction product가 존재하는 것으로 정의하였다. 대부분의 X-gal positive cell은 손상부위로 이동하여 뇌허혈의 중심부분(ischemic core)과 뇌허혈과 정상뇌조직의 경계부위(ischemic boundary zone)에 위치하고 있었으며(Fig. 2A and B), 손상부위의 반대측에서는 약간의 X-gal positive cell들이 혈관부위에 있음을 알 수 있었다(Fig. 2C-E). 
   이식한 세포의 분화를 확인하기 위해 이중 면역형광염색을 실시하였다. 일부의 X-gal positive cell들이 손상부위와 뇌허혈 경계부위에서 신경원의 세포표지자인 NeuN에 양성반응을 보였으며(Fig. 3A-I), 뇌허혈 경계부위에서 성상세포의 세포표지자인 GFAP에 양성반응을 보였다(Fig. 3J, K and L). 이것으로 이식된 세포 중 일부가 신경원과 성상세포로 분화하였음을 관찰 할 수 있었다. 

3. 실험동물의 행동평가 결과
   Modified Neurological Severity Scores test와 Rotarod test를 이용하여 행동분석을 하였다. 상기 검사는 세포를 이식한지 1, 3, 7, 14, 28, 56일 뒤에 각각 시행하였다. 
   mNSS test에서 group 1은 뇌허혈을 유발시킨 1일 후 평균 8점에서 28일 후 평균 6.5점, 56일 후 평균 6점으로 감소하였고, group 2는 1일 후 평균 8.8점에서 평균 6.2점, 평균 5.8점으로, group 3은 1일 후 평균 8.75점에서 평균 5점으로 각각 감소하였다. 뇌허혈 유발부터 56일 후 Group 1은 평균 8점에서 평균 6점으로 평균 2점이 감소되어 행동기능에서 25%의 호전을 보였고, group 2는 평균 8.8점에서 평균 5.8점으로 평균 3±1점이 감소되어 34%의 행동기능 호전을 보였으며, group 3에서는 평균 8.75점에서 평균 5점으로 평균 3.8±1.3점으로 감소하여 43.4%의 행동기능 호전을 보였다(Table 2).
   Rotarod test에서 group 1은 뇌허혈을 유발 시킨 1일 후 평균 58초에서 28일 후 평균 160.5초, 56일 후 평균 208초로 증가하였고, group 2는 1일 후 평균 63.2초에서 평균 174.6초, 평균 205.8초로, group 3은 1일 후 평균 46.8초에서 평균 211.3초, 250.5초로 증가하였다. Group 1은 56일뒤 평균 58초에서 평균 208초로 평균 150±10.4초 증가하여 258.6%의 호전을 보였고, group 2는 평균 63.2초에서 평균 205.8초로 평균 142.6±35.7초 증가하여 225.6%의 호전을 보였으며, group 3은 평균 46.8초에서 평균 250.5초로 203.7±38.4초 증가하여 435.8%의 호전을 보였다(Table 3).
   mNSS test에서 group 1과 group 2에서 이식 28일와 56일 후 신경학적 기능이 group 1보다 통계적으로 의미있게 호전되었으며(p<0.05), group 3이 group 2보다 통계적으로 의미있게 신경기능이 호전되었다(p<0.05). Rotarod test 또한 세포 이식 28일와 56일 후 모두에서 group 3이 group 1과 group 2보다 통계적으로 의미있게 신경기능이 호전되었다(p=0.05)(Fig. 4).

고     찰

   이번 연구에서 허혈을 유발시킨 동물모델에 아무것도 처리하지 않은 hMSC보다는 Ci-hMSC를 이식하는 것이 이식된 세포의 손상된 부위로의 이동율과 신경 세포로의 분화율을 더 높여서 신경 기능의 회복을 도모함을 알아보고자 하였다. hMSC를 정주하는 경우에 어디로든 갈 수 있고, 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 신경세포로 분화 유도된 hMSC를 이식한다면 아무것도 처리하지 않은 hMSC보다는 뇌 손상부위로의 이동율과 신경세포로의 분화율도 더 높아져서 신경회복 도모에 더 도움이 될 것으로 사료되었다.
   여러 저자에 의하여 이식된 줄기세포가 뇌허혈부위에 동화(intergration)되고 손상된 뇌조직을 재생한다는 것이 밝혀졌으며, Zhao 등은 이식된 hMSC가 rodent 뇌에서 생존하면서 신경원이나 성상세포 등으로 분화함을 보고하였다.²¹⁾³¹⁾ 본 실험에서도 hMSC와 Ci-hMSC가 이식 후 8주 후에도 생존하면서 신경세포로 분화 되고 신경기능이 향상되는 것을 관찰하였다. 이식된 hMSC는 주로 뇌허혈부위와 정상 뇌조직과의 경계부위에서 관찰되었고 신경원과 성상세포로 분화되었음을 관찰하였다.
   이론적으로 줄기세포는 모든 세포로 분화될 수 있기 때문에, 이들의 분화 메커니즘을 이해하고 원하는 세포로 분화시킬 수 있다면 난치병의 상당 부분을 치료할 수 있는 가능성이 있을 것으로 예상된다. 본 실험에서 행동평가검사 결과, hMSC 또는 Ci-hMSC를 이식한 군이 대조군보다 신경기능이 통계적으로 의미있게 호전되었으며, Ci-hMSC를 이식한 군이 가장 좋은 신경기능 회복을 보였다는 것은 이러한 가능성을 뒷받침하는 것으로 사료된다. 
   본 실험에서 대조군과 실험군간의 형태학적인 비교분석이 빈약하고, 각 군간 행동평가 검사상의 차이를 형태학적인 차이와 연관시키지 못한 것은 부족한 부분이라고 할 수 있다. 형태학적인 차이를 평가하기 위해서는 이식된 hMSC와 Ci-hMSC의 정량적인 검사가 필요할 것이다. 따라서 앞으로의 실험에서는 이식한 세포의 정량적인 평가 그리고 정량적인 차이와 행동평가의 차이를 비교 분석해야 할 것으로 사료된다. 또한 신경기능의 회복을 측정할 수 있는 행동실험을 좀 더 다양하고 세분화해서 동물의 신경기능의 변화를 명확하게 반영할 필요가 있을 것으로 여겨진다.

결     론

   뇌허혈을 유발시킨 쥐에 신경세포로의 분화를 촉진하는 성장인자를 처리한 Ci-hMSC를 이식하여 신경세포의 재생 및 허혈부위로의 이동을 관찰하고 신경기능의 회복을 평가한 후 다음과 같은 결론을 얻었다. 
   쥐의 꼬리정맥을 통하여 이식된 Ci-hMSC는 신경세포의 손상부위로 이동하여 신경원 및 성상세포로 분화되었다. 이식 후 시행한 mNSS test와 Rotarod test에서 이식 28일과 56일 후 모두에서 신경학적 결손이 대조군과 비교하여 통계적으로 의미있게 호전되었으며, Ci-hMSC를 이식한 경우가 분화 유도하지 않은 사람의 hMSC를 이식한 것보다 통계적으로 의미있게 기능의 호전을 보였다. 본 실험을 통하여 Ci-hMSC의 이식이 뇌졸중을 비롯한 퇴행성 신경계 질환들에 대한 잠재적 치료법으로서 가능성이 있음을 보여주었다. 

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